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Argonaute 蛋白存在于生命的所有三个王国领域，即古细菌、细菌和真核生物。与真核 Argonaute 蛋白使用小 RNA 向导靶向 mRNA 不同，一些原核 Argonaute 蛋白 (pAgos) 使用小 DNA 向导来干扰 DNA 和/或 RNA 靶标。然而，pAgo自然功能的机制仍然未知。

2022年3月28日，西北农林科技大学张智英及加拿大韦仕敦大学Joe S. Mymryk共同通讯在mBio（IF=7.87）在线发表题为“Prokaryotic Argonaute Protein from Natronobacterium gregoryi Requires RNAs To Activate for DNA Interference In Vivo”的研究论文，该研究使用基于异源大肠杆菌的模型系统研究来自 Natronobacterium gregoryi 的 pAgo(NgAgo) 靶向质粒和噬菌体 T7 DNA 的机制。该研究展示了从质粒表达的 NgAgo 使其表达载体线性化。共转化分析表明，NgAgo 需要从噬菌体 T7 启动子转录的反式 RNA 来激活共转化质粒的切割，这让人想起 CRISPR/Cas9 中的反式 RNA 功能。该研究提出了一种机制来解释 NgAgo 如何消除入侵的外来 DNA 和噬菌体。通过利用这一发现，该研究表明可以对 NgAgo 进行编程以靶向质粒或染色体基因座。

总之，该研究揭示了NgAgo 如何在 37°C 下消除细菌细胞中入侵的外源 DNA 和噬菌体的机制，并且通过利用这一发现，可以对 NgAgo 进行编程以靶向质粒或染色体基因座。

另外，2021年9月3日，普渡大学Kevin V Solomon团队在Nucleic Acids Research（IF=16.97） 在线发表题为“NgAgo possesses guided DNA nicking activity ”的研究论文，该研究发现NgAgo 在非嗜盐宿主中表达不佳，即使在重折叠后，大多数蛋白质仍不溶且无活性。然而，可溶性部分确实起到了切割 DNA 核酸内切酶的作用。NgAgo 与其他具有催化活性的 pAgo 共享规范域，但也包含以前无法识别的单链 DNA 结合域 (repA)。repA 和规范的 PIWI 结构域都参与了 NgAgo 的 DNA 切割活动。NgAgo 可以在大肠杆菌中和体外在指导序列 3′ 末端外 1 nt 处切割靶向 DNA。该研究还发现，这些核酸内切酶活性对于大肠杆菌中增强的 NgAgo 引导的同源重组或基因编辑至关重要。总的来说，该研究发现NgAgo 是一种新型 DNA 核酸内切酶，属于由特征 repA 结构域定义的未被识别的 pAgo 类。NgAgo 使用 PIWI 中保守的和新的未表征的 repA 结构域来切割 DNA。NgAgo的这种切割介导原核生物中的基因编辑作用。该研究工作建立了探索 NgAgo 活性（以及其他 pAgo 的活性）的创新方法，并确定了将其发展为下一代合成生物学工具的关键蛋白质特征。

2019年1月30日，华中农业大学张安定，金梅林，韩丽及同济大学项耀祖共同通讯在Nucleic Acids Research在线发表题为“The prokaryotic Argonaute proteins enhance homology sequence-directed recombination in bacteria”的研究论文，该研究发现Nagonobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）以80-100％的效率增强巴斯德氏菌和大肠杆菌中的基因插入或缺失， 有趣的是，在其他pAgos蛋白中也观察到这种效应，包括Thermus thermophilus Argonaute（TtAgo），Aquifex aeolicus Argonaute（AaAgo）和Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）。NgAgo作为一种独立于其潜在酶活性的有效阳性选择系统，主要通过其与重组酶A（recA）相互作用的PIWI样结构域来增强recA介导的DNA链交换。 该研究揭示了一种用于增强细菌中同源序列指导基因编辑的新系统。

Argonaute 蛋白是一个高度多样化的核酸酶家族，存在于所有三个生命王国领域。它们最初是在真核生物中作为 RNA 干扰系统的关键参与者被发现的，在该系统中，它们使用小 RNA 向导来定位 mRNA 靶标，以调节基因表达和抑制移动遗传元件。在细菌和古细菌中也发现了同源原核 Argonaute 蛋白 (pAgos)，但与真核 Argonaute 蛋白相比，它们的多样性极为丰富。

与真核生物不同，一些 pAgos 已被证明使用小单链 DNA (ssDNA) 作为向导，在体外作为对 DNA 靶标具有明显特异性的核酸酶。然而，指导 DNA 生成、DNA 靶标识别和 pAgos 在体内的自然功能的机制通常仍然是未知的。之前提出了一种用于生成小 DNA 向导的 DNA 切割机制：嗜热栖热菌 Argonaute (TtAgo) 和 Methanocaldococcus jannaschii Argonaute (MjAgo) 蛋白表现出不依赖于向导的核酸酶活性，被称为“切割活性”。

这种“切割活性”表现出两个特点：大多数“切割”底物来源于外来入侵的质粒或噬菌体，且“切割”活性极低。通过“切割”，pAgos 首先非特异性切割入侵的质粒或噬菌体，产生外源 DNA 的短片段，随后加载到 Argonaute 上。通过一种未知的机制，Argonaute 蛋白可以释放一条 DNA 链，同时保留另一条链作为向导 DNA。然而，装载有向导 DNA 的 pAgos 的自然功能仍然未知。

许多表达 pAgo 的天然宿主生活在恶劣和极端的环境中，因此很难表征同源宿主细胞中的 pAgo 功能。此外，大多数 pAgo 在 37°C 下在大肠杆菌 BL21 及其衍生物中表达不佳。因此，大多数已发表的 pAgo 研究都集中在使用体外切割测定的蛋白质结构和酶活性上，而体内研究的数据有限。因此，它们的体内功能仍然难以捉摸，功能表征有限。

文章模式图（图源自mBio ）

在本研究中，提供证据表明在大肠杆菌BL21(DE3) 细胞中异源表达的 NgAgo 使其表达载体线性化（基于 pET28a）。使用共转化实验，该研究确定 NgAgo 需要来自某些启动子的反式表达的 RNA 来靶向共转化的质粒，这为 NgAgo 诱导的 DNA 干扰，需要 RNA 在体内激活提供了有力的证据。

该研究还发现，在大肠杆菌BL21(DE3) 中表达的 NgAgo 可以保护细菌细胞免受 T7 噬菌体感染，从而显著减少 PFU 的产生并破坏 T7 基因组 DNA。该研究提出了一种机制，其中 NgAgo 以 RNA 激活的方式干扰外源 DNA。这一发现提供了对 NgAgo 进行编程以靶向外源核酸的工具，包括质粒和基因组位点。

另外，2016年5月3日，韩春雨团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的研究论文，该研究发现Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）是一种DNA引导的核酸内切酶，适用于人类细胞的基因组编辑，这一下子使NgAgo火遍全球，广大研究人员去验证其效果，很不幸，没有相关的团队能确定NgAgo有基因编辑的功能。

随后引发广泛质疑，2017年8月3日，韩春雨撤回该论文。不过，其他团队有另外的发现，南通大学刘东团队在Cell Research 发表题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的研究论文，该研究发现gDNA / NgAgo可以与靶基因结合以阻断其转录，同时该研究也没有发现NgAgo具有基因编辑的能力。

参考消息：

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03656-21

题图来源：自制

投稿：zhanglanxin@dxy.cn

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