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由病毒引起的传染病对人类健康一直有着潜在或直接的威胁，包括人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)、流感、丙型肝炎病毒(HCV)等。近几年，新冠病毒对世界范围各国的公共卫生都造成了严重的威胁，而已开发的治疗和预防策略受到病毒进化和突变的严重挑战。因此，开发广谱病毒抑制剂是一项具有深远意义的研究。

为此，来自南京大学的刘震教授联合北京微生物与流行病学研究所的秦成峰研究员共同设计了一种全新的抗病毒策略，用高价甘露糖结合纳米颗粒靶向病毒多糖屏障（图1）。纳米颗粒表现出独特的双拳机制，不仅能够阻断病毒-受体相互作用，还能够诱导病毒聚集，从而抑制病毒进入并促进病毒的吞噬。

相关研究成果以“Rational Development of Hypervalent Glycan Shield-Binding Nanoparticles with Broad-Spectrum Inhibition against Fatal Viruses Including SARS-CoV-2 Variants”为题于2022年11月15日发表在《Advanced Science》上。

图1 高价甘露糖纳米蛋白抑制病毒的示意图

1. 纳米聚合物的制备和表征

首先，作者根据最近一种叫做反相微乳液限制的面向表位的表面印迹和包层(ROSIC)的方法合成了纳米聚合物（图2），同时进行了优化设计。选择原硅酸四乙酯(TEOS)作为形成二氧化硅骨架的单体。此外，合成了用2，4-二氟-3-甲酰基苯基硼酸修饰的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(DFFPBA-APTES)作为另一种单体，其通过单体的硼基团和顺式二羟基基团之间的相互作用提供了结合甘露糖的共价力。单体聚合后，人印迹纳米粒子从微乳液中释放出来，提取模板，留下在形状、大小和功能方面与甘露糖互补的良好形成的印迹空腔。此外，为了提高生物相容性和稳定性，该印迹纳米粒子被聚乙二醇(PEG)包覆。优化后的nanoMIP的识别性能优于一些甘露糖结合凝集素(MBL), nanoMIP的特异性已被广泛接受，具有全身或局部给药的良好潜力。

图2 纳米聚合物的设计与表征

1. NanoMIP作为高甘露糖聚糖的人工抗体

为了验证nanoMIP作为针对高甘露糖聚糖的人工抗体的可行性，通过biolayer interferometry (BLI)研究了用高甘露糖聚糖修饰的不同蛋白质的结合亲和力和动力学（图3）。基于实验结果表明，所述纳米蛋白可以作为具有足够亲和力的高甘露糖聚糖的有效人工抗体。考虑到在新型冠状病毒峰上观察到的28%的N-连接聚糖组成是甘露寡糖聚糖，作者通过BLI进一步验证了nanoMIP与新型冠状病毒假病毒的靶结合能力。显著增强的结合强度表明，nanoMIP可以结合对聚糖屏蔽具有高亲和力的病毒体。此外，作者还探究了nanoMIP与新型冠状病毒受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)的竞争性结合，结果表明了nanoMIP对新型冠状病毒S1和ACE2结合的阻断作用。

图3 用生物层干涉测量法研究纳米聚合物的结合亲和力和竞争结合

1. 通过抗聚糖屏障广谱抑制病毒

由于纳米蛋白对新型冠状病毒和ACE2之间的结合表现出有效的阻断作用，因此进一步研究了纳米蛋白对新型冠状病毒感染的抑制功效。通过冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM)观察纳米虫和新型冠状病毒假病毒(慢病毒假颗粒)的复合物（图4a），观察到多个纳米粒子与一个新型冠状病毒假病毒粒子的结合，而对于NIP对照没有观察到明显的结合。

图4 通过nanoMIP抑制新型冠状病毒假病毒与ACE2-HEK293T细胞的附着

之后将一种假型病毒用于假病毒中和试验，该假型病毒包装有新型冠状病毒刺突(野生型)并含有绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶报告基因的基因组（图5）。通过暴露于假病毒后48小时的荧光素酶活性测定，该纳米制剂对新型冠状病毒野生型假病毒显示出最大90.2%的抑制效率（图5a）。为了进一步验证广谱抗病毒策略的效力，还研究了NanoMIP对LASV和HIV-1假病毒的中和能力。研究了纳米制剂对宿主细胞的细胞毒性，发现纳米制剂对TZM-bl细胞没有明显的细胞毒性。在LASV假病毒的情况下，NanoMIP阻断了约95.5%的假病毒感染细胞；该纳米制剂对HIV-1假病毒表现出97.2%的假病毒阻断作用。

图5 纳米粒子的广谱抗病毒能力

1. Nano MIP诱导的病毒聚集

受假病毒中和效力的优异效果，进一步研究了聚糖屏蔽结合纳米蛋白的抑制机制。采用负染高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)观察用或不用nanoMIP处理的野生型新型冠状病毒假病毒病毒体的形态。对于对照组，未经处理的病毒体分散成个体，清晰且易于观察。相比之下，用nanoMIP处理的病毒体大多成簇，在这些簇之外很少观察到单个病毒体（图6a）。

接下来，通过巨噬细胞吞噬作用进一步评估由nanoMIP诱导的病毒聚集体的免疫效果。由nanoMIP诱导的病毒聚集可以很好地增强巨噬细胞吞噬作用，激活先天免疫，并促进病毒的裂解，这将进一步抑制病毒进入宿主细胞（图6c）。

图6 纳米蛋白诱导的病毒聚集

此外，在感染72小时后，在用nanoMIP处理的Vero细胞单层上观察到很少或没有细胞病变效应(CPE),而用NIP或MBL处理的Vero细胞显示出明显的细胞病变效应(图7c–f)，这种优异的抗病毒效果被认为得益于通过纳米滴阻断病毒进入并诱导病毒聚集。

图7 有效抑制活病毒的结果

综上，本文开发了一种具有纳米级和刚性结构的超价聚糖屏蔽结合人工抗体，对多种病毒进行有效和广谱的抑制。由于这种独特的双拳(阻断和交联)机制，超价甘露糖结合纳米蛋白为有效和广谱抑制不同种类的病毒提供了前所未有的策略，将重点从传统策略(如抗体和疫苗)中多变和突变的肽抗原或表位转移到聚糖屏障，从而克服了与病毒多样性和突变相关的问题。可以预见，这种高价聚糖屏蔽靶向策略将为广谱病毒抑制开辟了新的途径。

文章来源：https://doi.org/10.1002/advs.202202689

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