南京理工大学研究生(南京理工大学研究生院)

南京理工大学研究生，南京理工大学研究生院

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

炎症性肠病（IBD）是一种慢性炎症性胃肠道疾病，肠道菌群的失衡是其发展的关键因素。天麻（G.elata）是兰科植物，以其营养和药用价值而闻名。研究表明，天麻多糖（GBP）具有抗炎特性，可以改善IBD。然而，GBP对肠道菌群代谢的改善作用仍然未知。因此，我们旨在检测天麻提取物和GBP对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD小鼠的治疗潜力。GBP可最大程度地减轻小鼠IBD症状从而表现出最佳的疗效。GBP导致具有潜在抗炎作用的细菌（如Ligilactobacillus和Alloprevotella）的相对丰度显著增加，并导致与促炎反应相关的细菌水平下降，如拟杆菌和大肠埃氏-志贺氏菌。此外，我们在粪便中发现了模型组和GBP组之间存在36种显著差异代谢产物，主要富集于氨基酸代谢，包括色氨酸和半胱氨酸、维生素B6代谢和类固醇激素生物合成。因此，肠道微生物群的代谢调节可能是GBP改善IBD的作用机制。

亮点：

1.天麻多糖GBP改善DSS诱导的IBD小鼠的症状；

2.GBP减少了结肠炎引起的促炎细胞因子；

3.GBP调节了抗/促炎细菌的相对丰度；

4.差异代谢物富集于色氨酸代谢、维生素B6代谢和类固醇激素生物合成。

论文ID

原名：Therapeutic efficacy and underlying mechanisms of Gastrodia elata polysaccharides on dextran sulfate sodium-induced inflammatory bowel disease in mice: Modulation of the gut microbiota and improvement of metabolic disorders

译名：天麻多糖对小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病的治疗效果和潜在机制:调节肠道微生物群和改善代谢紊乱

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：8.2

发表时间：2023.07

通讯作者：汪俊松，徐迪

通讯作者单位：南京理工大学

实验设计

实验结果

1. 天麻提取物和GBP对DSS诱导的IBD模型小鼠的治疗作用：DAI、结肠长度和组织学分析

为了评估不同天麻提取物对小鼠的治疗作用，我们使用3%DSS溶液诱导小鼠IBD（图1）。急性IBD通常会导致体重下降、腹泻、粪便出血甚至死亡。因此，我们计算疾病活动指数（DAI）来评估提取物对IBD小鼠的治疗效果。DAI包括对体重、腹泻和出血评分的评估，并基于人类IBD的临床症状。如图2B所示，在第5天开始口服GBP后，与模型组不同，DAI评分从第6天到第13天显著降低。此外，GBP和天麻水提取物在第13天比乙酸乙酯提取物更有效地减轻了体重减轻（图2A）。

图1 GBP、水提取物和乙酸乙酯提取物对DSS诱导的IBD模型小鼠的实验设计

我们采集结肠样本，解剖后测量结肠长度。与模型组相比，GBP、水提取物和乙酸乙酯提取物处理显著增加了小鼠的结肠长度（图2C、D和S1）。GBP处理组的结肠长度最长（p＜0.0001），其次是水提取物处理（p＜0.001）和乙酸乙酯提取物处理（p＜0.001）。组织学分析显示，DSS导致炎症性肠病小鼠结肠中的炎症细胞浸润、中度黏膜下水肿以及隐窝和杯状细胞的损失，如图3、S2和S3所示。GBP处理恢复了杯状细胞数量和隐窝深度，减少了炎症细胞浸润和黏膜水肿。因此，GBP可以减轻DSS诱导的IBD小鼠病理损伤。此外，我们分离纯化了GBP，得到了两种均匀的多糖，GBP1和GBP2。它们的平均摩尔质量（Mw值）分别为1.435*106 g/mol和1.913*106 g/mol（表S1），其单糖组成主要包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸（表S2）。GBP的化学成分和结构仍需全面分析。提取的粗GBP被证明对IBD症状具有最佳的治疗效果，包括体重减轻、腹泻、粪便出血和结肠长度缩短。因此，GBP对DSS诱导的小鼠IBD具有最佳的治疗效果，并被用于探索其潜在机制。

图2 天麻提取物和GBP对DSS诱导的IBD小鼠的治疗作用

（A）解剖当天的体重；（B）DAI得分；（C，D）结肠长度。MOD：模型组；CON：正常组，GBP：GBP处理组；E：乙酸乙酯提取物组；W：水提取物组。数据以平均值±SEM表示，并通过单因素方差分析（n=8）进行分析。与MOD相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

2. GBP对DSS诱导的IBD小鼠全身炎症反应的调节作用

为了研究GBP对IBD炎症反应的潜在影响，我们评估了血清和结肠组织中的促炎细胞因子水平（图4）。与正常组相比，DSS显著增加了血清中促炎细胞因子IL-1ß、TNF-α和IL-6的水平（图4A–C）。我们在结肠组织中测量这些促炎细胞因子的mRNA表达。结果显示，与正常组相比，DSS处理上调了这些细胞因子的mRNA水平（图4D–F）。然而，GBP处理显著降低了血清中这些细胞因子的水平，接近正常组的水平。此外，GBP下调了结肠组织中这些细胞因子的mRNA表达。这些结果表明，GBP可以降低IBD小鼠血清和结肠组织中促炎细胞因子IL-1ß、TNF-α和IL-6的水平。因此，GBP的抗炎作用可能是其治疗IBD潜力的基础。

图3 正常组、模型组、GBP组、水提取物组和乙酸乙酯提取物组小鼠结肠组织的代表性病理切片

比例尺分别为500μm和200μm。箭头表示隐窝结构丧失、杯状细胞耗竭和细胞浸润增加的区域。

3. GBP对DSS诱导的IBD小鼠肠道菌群组成和多样性的调节作用

3.1 GBP调节对肠道菌群多样性的调节作用

肠道微生物群紊乱被认为是IBD最重要的致病过程之一。为了探索肠道微生物群在IBD中的作用，我们进行了16S rRNA基因测序，并分析了粪便中OTU的数量，以评估肠道微生物群的丰富度。如图S4A所示，OTU的数量在正常、模型、GBP、水提取物和乙酸乙酯提取物组之间相当（分别为2418、2479、2326、2404和2545），表明肠道微生物群在组成上是不同的。模型组和正常组共有1790个OTUs，而GBP组和正常对照组共有1748个OTUs（图5A）。模型组有452个独特的OTUs，而GBP组有341个独特的OTUs。这表明，虽然DSS和GBP没有显著改变肠道微生物群的丰富度，但它们对肠道微生物群群落组成的影响不同。此外，基于不同天麻提取物处理组和模型组之间OTU的相对丰度，肠道微生物群PCA评分图中的明显分离表明，IBD小鼠的细菌组成向正常小鼠的细菌成分整体转移（图S5）。具体而言，GBP、乙酸乙酯提取物和水提取物组均与模型组分离，并聚集在更接近正常组的位置，表明所有三种天麻提取物都改善了IBD小鼠肠道微生物群的微生态失调。此外，我们还计算了α多样性指数，包括观测物种（OS）、Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数，以评估物种丰度和多样性（表1）。16S rRNA基因测序分别在正常组、模型组和GBP组中鉴定了723、689和694个OS。尽管模型组和GBP组中观察物种没有表现出比正常组显著更低的水平，Shannon指数显示，模型组的肠道微生物群多样性显著低于正常组。GBP处理恢复了多样性（p<0.05）（表1）。这些结果与之前的研究一致，表明IBD的肠道微生物群丰富度基本保持稳定，但群落结构被严重破坏。微生物组成而非丰度的变化可能是GBP对结肠炎的微生物群介导作用的基础。这些发现强调了在分析对肠道菌群的影响时评估alpha多样性的重要性。

图4 GBP对促炎细胞因子的影响

（A）通过ELISA测量血清中的IL-1ß水平（n＝4）；（B）ELISA法测定TNF-α水平；（C）通过ELISA测定IL-6水平。（D）结肠组织中IL-1ß的基因转录水平（n=7）；（E）TNF-α的基因转录水平；（F）IL-6的基因转录水平。数据表示为平均值±SEM。与MOD相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3.2 GBP对门和属水平肠道菌群丰度的调节作用

我们分析了门和属水平上肠道微生物群的变化，如图5B、C和S4所示。IBD小鼠中厚壁菌门的相对丰度降低，变形杆菌的相对丰度增加（图5B，表2）。先前研究的结果显示，IBD患者肠道微生物群水平发生了类似的变化。先前的一项研究指出，2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的IBD小鼠的厚壁菌门水平降低，包括疣微菌科和毛螺菌属。另一项研究显示，在DSS诱导的IBD小鼠中，Proteobacteria_Enterobacteriaceae和Bacteroidota_Bacteroides的相对丰度显著增加。然而，关于哪种细菌是IBD的病因，目前还没有达成共识或明确的证据。在我们的研究中，与模型组相比，GBP处理显著增加了拟杆菌门的相对丰度，并降低了变形菌门和疣微菌门的相对丰度。与模型组相比，水提取物和乙酸乙酯提取物还显著增加了拟杆菌门的相对丰度，并降低了变形菌门的相对丰富度（图S4B）。这些结果与属水平的相对丰度变化一致，如图5C和表3所示。在属水平上，GBP处理显著增加了Ligilactobacillus和Alloprevotella的相对丰度，同时降低了拟杆菌和大肠埃氏-志贺氏菌的相对丰度。这些变化可能是由于GBP抑制了某些肠道变形杆菌病原体的生长，并改善了特定厚壁菌门益生菌的生长。然而，水提取物增加了Alloprevotella的相对丰度，而乙酸乙酯提取物增加了Ligilactobacillus的相对丰度（图S4C）。水提取物和乙酸乙酯提取物降低了大肠埃氏-志贺氏菌的相对丰度。为了进一步探索GBP处理后不同组微生物群的差异，我们基于LEfSe线性判别分析（LDA）估计了不同丰度的影响。LDA显示，各组之间的优势细菌存在差异（图5D–E）。Alloprevotella和Dubosiella在正常组中占优势，大肠杆菌和阿克曼氏菌在模型组中占主导地位，Muribaculaceae在GBP组中占统治地位。

表1 测序数据和主要不同三组之间的α多样性

GBP可改善DSS诱导的IBD小鼠的肠道微生物群失调。潜在抗炎细菌Firmicutes_Ligilactobacillus和Bacteroidetes_Alloprevotella的水平显著增加，潜在促炎细菌Proteobacteria_Escherichia-Shigela的水平下降，证明了这一点。乳杆菌是一种很有前景的益生菌，具有抗菌活性、抗炎作用和维持肠道微生物群平衡的能力。口服Ligilactobacillus salivarius Li01改善了IBD小鼠的肠道屏障和肠道微生物群。Ligilactobacillus通过减少炎症细胞因子的产生，包括TNF-α、IL-6和IL-1β，在体外和体内具有抗炎作用。因此，可以推测，GBP处理后IBD小鼠炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平的降低可能是由于肠道中Ligilactobacillus水平的增加。此外，肠杆菌科是一个包括沙门氏菌、埃希氏杆菌和志贺菌等病原体在内的革兰氏阴性菌科，并且与IBD密切相关。高丰度的埃希氏杆菌和志贺菌会促进肠道上皮屏障的炎症损伤。因此，在GBP处理后，与炎症细胞因子释放相关的大肠埃氏-志贺氏菌的水平降低到与正常组相似的水平（表3）。我们的研究结果强调，GBP的使用有可能通过调节肠道微生物群和通过促进肠道健康的抗炎微生物环境来减少炎症，从而成为治疗IBD的一种方法。此外，这项研究证明了与炎症相关的细菌相对丰度和肠道菌群平衡的特定变化，这可以作为评估IBD治疗效果的潜在生物标志物。总之，这项研究为GBP治疗IBD的潜在益处及其对肠道菌群的影响提供了新的见解。

表2 门水平上优势分类的相对丰度

表3 属水平上优势分类的相对丰度

图5 GBP处理对小鼠肠道菌群的影响

（A）GBP处理后OTU的Venn图；（B）肠道微生物群在门水平上的相对丰度；（C）属水平上肠道微生物群的相对丰度；（D）LEfSe获得的差异富集微生物分支图；（E）LDA得分高于4的某些分类群的富集。

4. GBP对DSS诱导的IBD小鼠肠道微生物代谢谱的影响

除了肠道微生物群的调节外，代谢变化也是IBD的重要标志。肠道微生物群的变化部分归因于GBP对肠道的直接影响，而不仅仅是其抗炎作用，因为GBP可以改变微生物群落结构和代谢。SCFAs在结肠炎的治疗中很重要，是在肠道微生物群代谢多糖时产生的，但其他微生物群衍生的代谢产物研究较少。因此，我们进行了一项非靶向粪便代谢组学分析，以研究不同天麻提取物对DSS诱导的IBD的治疗作用。PLS-DA和PCA评分图（图6A–B）显示，模型组与正常组分离良好，显示出DSS诱导的代谢变化。GBP和乙酸乙酯提取物组与模型组之间的距离大于水提取物组与模型组之间的间距，这意味着GBP和乙酸乙酯提取物具有更强的调节作用。相反，水提取物组更接近模型组，这表明与GBP和乙酸乙酯提取物组相比，水提取物组在将代谢谱恢复到正常水平方面的有效性较低。总之，这些发现表明，GBP和乙酸乙酯提取物对代谢的治疗效果比水提取物更好。

图6 UPLC TripleTOF MS/MS鉴定的代谢产物谱分析

（A）五组之间粪便代谢物的PLS-DA评分图；（B）五组粪便代谢物的主成分分析图；（C）五组之间显著不同代谢物的热图。MOD与CON相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01；与MOD相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

GBP改善了DSS诱导的IBD的症状，病理和炎症结果证明了这一点。代谢分析显示了GBP组和模型组之间存在进一步差异。我们在粪便中共鉴定出GBP组和模型组之间的36种不同代谢物，如图6C所示。我们使用MetaboAnalyst 5.0对这些代谢物进行途径富集分析，它们在多种途径中显著富集，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、氨基酸代谢（色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）、维生素B6代谢、半乳糖代谢、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢以及淀粉和蔗糖代谢（图7，表4）。进一步的通路分析显示DSS处理显著增加了13种代谢产物的水平，包括参与色氨酸代谢的5-甲氧基吲哚-3-乙酸；参与苯丙氨酸代谢的二氢-3-香豆素酸和苯丙酮酸；参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的L-半胱氨酸和L-半胱氨酸；参与组氨酸代谢的组胺；参与烟酸和烟酰胺代谢的烟酸；5-氨基戊酸和2-氧代己二酸参与赖氨酸降解；α-D-葡萄糖、UDP-α-D-葡糖和UDP-α-D半乳糖参与半乳糖代谢和参与己内酰胺降解的环己氨磺酸。GBP处理逆转了DSS对这13种代谢产物含量的影响。此外，DSS导致23种代谢产物的水平显著降低，这些代谢产物主要包括参与色氨酸代谢的血清素、褪黑素和6-羟基褪黑素；参与组氨酸代谢的肌肽；参与类固醇激素生物合成的雌酮、17ß-羟基-5α-雄甾烷-3-酮、3α-羟基-5ß-雄甾烷-17-酮、可的松、孕烯醇酮和骨化三醇；参与维生素B6代谢的5′-磷酸吡哆醛和吡哆醛；参与生物素代谢的生物素；参与视黄醇代谢的9-顺式-维甲酸和all-trans-18-hydroxyretinoic acid；参与不饱和脂肪酸生物合成的γ-亚麻酸。与因DSS处理而显示水平增加的代谢物类似，GBP逆转了DSS处理对这23种代谢物含量的影响。本研究中使用的非靶向代谢组学方法允许鉴定IBD改变和GBP调节的多种代谢产物。这些结果表明，GBP可以将IBD小鼠的代谢状况恢复到更接近正常的水平，表明其作为IBD治疗剂的潜力。

图7 GBP治疗后不同代谢产物的代谢途径分析

（A）前25种代谢途径的富集概述；（B）代谢物集富集分析。（a）氨基糖和核苷酸糖代谢；（b）色氨酸代谢；（c）维生素B6代谢；（d）半乳糖代谢；（e）类固醇激素生物合成；（f）组氨酸代谢。

我们比较了模型组和GBP组的代谢特征，结果表明，GBP处理对氨基酸代谢（色氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）、维生素B6代谢和类固醇激素生物合成具有特异性影响。先前的研究也报道了IBD中氨基酸代谢的改变，包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和亮氨酸代谢的改变。其中色氨酸代谢与IBD的发病机制特异性相关。在我们的研究中，DSS处理显著降低了5-甲氧基吲哚-3-乙酸的水平，但显著增加了参与色氨酸代谢的血清素、褪黑素和6-羟基褪黑素的水平。这与肠道微生物群可以分解色氨酸以激活免疫系统并损害IBD肠道屏障的假设一致。GBP处理后，这些色氨酸代谢产物的水平恢复到正常水平（图6C），表明GBP可能通过调节色氨酸代谢来减轻IBD，以减少免疫激活并保持肠道屏障完整性。粪便样本的代谢组学分析最近表明，在疾病发展过程中，代谢变化与肠道微生物群紊乱之间存在相关性，包括肥胖、非酒精性脂肪肝和克罗恩病。Spearman的相关性分析是在属水平上进行的，以探索肠道微生物群变化水平与粪便代谢产物之间的相关性（图8）。Ligilactobacillus和Alloprevotella水平与血清素、褪黑激素和6-羟基褪黑激素水平呈负相关，同时与5-甲氧基吲哚-3-乙酸水平呈正相关。然而，拟杆菌和大肠埃氏-志贺氏菌的水平与血清素和6-羟基褪黑激素水平呈正相关，但与5-甲氧基吲哚-3-乙酸水平呈负相关。拟杆菌的丰度与褪黑激素水平呈正相关，而大肠埃氏-志贺氏菌的丰度则与褪黑素水平无关。我们的研究结果表明，这些抗/促炎细菌与色氨酸代谢产物的变化之间存在强烈的相关性。这种相关性分析可以帮助我们更好地理解肠道菌群改变和粪便代谢物紊乱之间的功能关系，从而可能有助于制定IBD的个性化治疗策略。该分析还表明，参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的L-胱氨酸和L-半胱氨酸水平在模型组中增加，表明氧化应激的能力增强。GBP使L-胱氨酸和L-半胱氨酸的含量恢复到正常组的水平，表明GBP调节氧化应激以维持肠道微生物群的稳态。总之，我们发现GBP恢复了DSS诱导的紊乱的氨基酸代谢，表明调节氨基酸代谢是GBP治疗IBD疗效的重要机制。

表4 最显著的代谢途径富集分析显示p和影响值的列表

图8 属水平肠道微生物群紊乱与粪便代谢产物改变之间Spearman相关性的热图

维生素B6代谢似乎与IBD高度相关。维生素B6（吡哆醇）是一种水溶性维生素，以5′-磷酸吡哆醛（PLP）的形式与血清白蛋白结合。PLP作为一种辅酶，参与超过140种细胞反应，包括转氨、脱羧、反式硫化和几种神经递质的合成。对61名IBD患者的评估发现，活动期患者的血浆PLP水平低于缓解期患者。另外2名IBD加重患者也出现维生素B6缺乏。在我们的研究中，参与维生素B6代谢的PLP和吡哆醛的水平在DSS诱导的IBD小鼠中也降低了。类固醇激素代谢在维持肠上皮细胞（IEC）的稳态方面发挥着重要作用，形成了将免疫细胞与细菌分离的生化和物理屏障。IEC功能障碍可能在IBD的发病机制中起关键作用。参与所有类别类固醇激素生物合成的HSD11B2、HSD3B1和HSD3B2在IBD患者发炎的肠黏膜中被下调。与转录组学结果一致，研究者们发现6种潜在的生物标志物参与类固醇激素的生物合成。IBD小鼠的雌激素、17ß-羟基-5α-雄甾烷-3-酮、3α-羟基-5β-雄甾烷-17-酮、可的松、孕烯醇酮和骨化三醇的含量降低。因此，类固醇激素代谢与IBD的发病机制有关。GBP给药可使IBD小鼠的维生素B6代谢产物和类固醇激素代谢产物显著恢复到正常水平。然而，水提取物处理并没有这种调节维生素B6代谢的治疗效果。总之，本研究阐明了色氨酸代谢、维生素B6代谢和类固醇激素生物合成在IBD发病机制中的重要性（图9）。这些代谢途径与IBD的发病机制有关，研究结果表明，GBP有可能调节这些代谢途径，从而改善IBD。这些发现具有重要的临床意义，因为它们可能有助于开发新方法靶向这些代谢途径，从而治疗IBD。

图9 DSS诱导的IBD小鼠中GBP保护的潜在机制

红色箭头表示肠道微生物群的相对丰度增加，而蓝色箭头表示相对丰度减少。红色的代谢物代表在DSS诱导的IBD小鼠中GBP处理后水平显著增加的代谢物，而蓝色代表水平显著降低的代谢物。

结论

本研究在DSS诱导的IBD小鼠模型中研究了从天麻中分离的GBP治疗作用和潜在机制。GBP减轻了IBD的症状，包括体重减轻、结肠长度缩短和炎症浸润。具体而言，GBP治疗通过增加Firmicutes_Ligilactobacillus和Bacteroidetes_Alloprevotella水平以及Proteobacteria_Escherichia-Shigella水平来恢复肠道微生物群失衡。潜在抗炎细菌Ligilactobacillus水平的增加和促炎细菌大肠埃氏-志贺氏菌水平的降低可能是评估IBD治疗效果的差异生物标志物。此外，GBP特别影响氨基酸代谢、维生素B6代谢和类固醇激素生物合成，这与IBD的发病机制有关。据推测，GBP可能通过调节这些特定的代谢产物来作用于IBD。这项研究还强调了了解肠道微生物群和粪便代谢产物在疾病发展中关系的重要性。总之，本研究全面了解了GBP对IBD的治疗作用，并阐明了其治疗作用的潜在机制。这项研究的发现可能为开发IBD和其他肠道相关疾病的新治疗方法提供信息。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813023028143

【福利时刻】购买细胞及相关实验，扫码或加微信（1278317307）入群。

本公众号已与浙江慧通测评动物实验中心搭建紧密的合作关系：该动物中心已获得动物使用许可并在建动物行为学实验中心，如您需要含药血清制备-成分分析、灌胃给药、造模、药理、毒理以及相关实验技术支持，欢迎联系我们（1278317307）！

【福利时刻】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。

南京理工大学研究生(南京理工大学研究生院)

未经允许不得转载：考研培训网 » 南京理工大学研究生(南京理工大学研究生院)