药理学考研(药理学考研考哪些科目)

药理学考研，药理学考研考哪些科目

摘 要：目的 通过网络药理学及设计空间法对乳腺康提取工艺参数进行研究。方法 借助网络药理学对乳腺康潜在的活性成分进行筛选，并与酪氨酸激酶进行分子对接，结合《中国药典》2020年版确定指标性成分，采用HPLC法运用设计空间进行乳腺康提取工艺研究。结果 筛选出乳腺康中甘草查尔酮A、川陈皮素、蒲公英甾醇等核心成分与酪氨酸激酶的亲和力与临床推荐用药相似；设计空间得到最佳提取工艺：浸泡时间为30 min、溶媒量为12倍、提取时间为45～75 min、乙醇体积分数为65%～80%、提取2～3次。结论 实验所得到的工艺合理可行，验证实验与理论值预测值接近，具有一定的实用价值。该研究基于质量源于设计（QbD）理念的乳腺康提取工艺，稳定可靠，为其进一步的工艺开发及质量控制提供思路。

全球乳腺癌发病率逐年增加，在女性患恶性肿瘤的患者中，乳腺癌的病死率高居第1 位 [1] 。目前，乳腺癌的治疗仍以手术、放化疗、分子靶向治疗等为主。西医治疗可直接杀死肿瘤细胞，同时也会损害患者自身正常细胞及免疫系统，随着中医药研究的进步，各种含有中药及其有效成分的新型抗乳腺癌药物的研发，为乳腺癌新的治疗带来可能性 [2] ， 如药物参一胶囊、康莱特注射液 [3] 、复方斑蝥胶囊等 [4] 。《中国药典》2020 年版一部收载69 种中药用于乳腺癌疾病的治疗，但多为提高机体自身免疫力。青皮甘草散收载于清代医书《医宗金鉴》卷四十九，由青皮、甘草组成，主治“乳岩”，乳腺康源于青皮甘草散，经加减化裁得到的临床经验方，由青皮、甘草及蒲公英3 味药材配伍而成，青皮疏肝破气，用于乳癖、乳痈；甘草解毒，补益气；蒲公英清热解毒，消肿散结，用于乳痈；三药合用，共凑清热解毒、活血消肿、化瘀散结之功。本课题组 [5-6] 前期已经对乳腺康注射液质量标准及药效学进行研究。目前，中药复方的提取工艺研究多采用单因素和正交设计实验，无法达到实际提取工艺参数的动态性。设计空间 [7] 已被证明为可以保证质量的输入变量和工艺参数的多维组合，在此空间里允许工艺参数的波动，即在设计空间内发生的工艺参数改变通常不被视为工艺变更，不会影响对结果的综合要求，有助于结合产品质量属性控制目标成分，不仅可以有效在误差方面减少损失，还可以提高工艺参数和产品质量之间的关联性。

目前，多数中药工艺研究过程中，多以药材的指标性化学成分作为工艺筛选的指标，但这些化学成分是否与药物临床药效相关尚未可知，本研究借助网络药理学及分子对接技术 [8] 对乳腺康有效活性成分进行筛选，得到活性成分群并作为指标性成分，采用设计空间法对乳腺康提取工艺进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters-2695 型高效液相色谱仪、Photodiode Array Detector 型检测器，美国Waters 公司；SQP 电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；FA2004 分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；800Y 型高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；MH-3000 型调温电热套，北京中兴伟业世纪仪器有限公司；PS-40 超声波清洗器，AC 200 ～240 V ，50 Hz ，深圳得康清洗设备有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 材料

青皮（批号180718 ）、甘草（批号200703 ）、蒲公英（批号190208 ）均购自成都市荷花池药材市场，经成都大学药学院刘涛教授鉴定，分别为芸香科柑橘属植物橘 Citrus reticulata Blanco 的果皮、豆科甘草属植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根及菊科蒲公英属植物蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz. 的干燥全草；对照品橙皮苷（批号wkq18040203 ）、川陈皮素（批号wkq20031701 ）、甘草查尔酮A （批号wkq20022102 ）、咖啡酸（批号140107 ）、甘草酸铵（批号140227 ），质量分数均≥98% ，均购自四川省维克奇生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 乳腺康网络药理学研究

2.1.1 乳腺康成分搜集 采用中药系统药理学数据库和分析平台（traditionalChinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中药分子机制生物信息学分析工具（bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditionalChinese medicine，BATMAN-TCM，http://bionet. ncpsb.org/batman-tcm），结合中国天然产物化学成分库，检索获得乳腺康所含的化学成分，表1为筛选出的主要活性成分。

2.1.2 活性化合物及靶标蛋白的筛选 口服生物利用度（OB）是药物吸收、分布、代谢、排泄（ADME）中最重要的药代动力学参数之一，参考文献方法[9]在TCMSP数据库中用OB≥30%和DL≥0.18筛选乳腺康的活性成分，并利用TCMSP数据库中的靶点预测功能收集乳腺康中化学成分的靶标蛋白，借助UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），通过导入蛋白名称并设定物种为人，将检索得到的所有的蛋白靶标校正为UniProtID，并得到靶标蛋白所对应的基因名PTGS1、SCN5A、HSP90AB1、F2、F10 ACHE等共计382个。

2.1.3 筛选疾病基因靶点及韦恩图构建 利用比较毒理基因组学数据库（comparative toxicogenomics database，CTD，http://ctd.mdibl.org/），以关键词“乳腺癌”及“breast cancer”进行搜集，得到10万余个基因靶点，根据“Inference score”，选取数据库中前500个基因靶点。将乳腺康得到的382个成分基因靶标与利用比较毒理基因组学数据库筛选出乳腺癌的前500个疾病基因靶标进行韦恩图构建，结果见图1。

2.1.4 成分-靶标-通路相互作用网络的构建 先将化合物基因导入蛋白质相互作用分析平台STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl），获取蛋白相互作用的关系，再将成分、靶标、通路导入CytoscapeVersion 3.7.2软件构建成分-靶标-通路网络。设置节点度（degree）值大于所有节点连接2倍中位数为标准进行筛选，确定关键节点，探究乳腺康的作用机制。

成分- 靶标- 通路相互作用网络总共包括165 个节点（71 个成分节点、74 个靶标节点、20 个通路节点）和1367 条边，如图2 所示，其中圆形代表基因靶点，菱形代表成分，三角形代表通路。一个节点的度值表示网络中和节点相连的节点的数量，相互作用构成成分- 靶标- 通路网络，根据网络中的拓扑学性质筛选出来的中心度值、亲中心度值、等级值较大的节点进行分析，越能连接化合物或者靶点的节点在网络中越能发挥枢纽作用，在该网络中每个成分平均与13.51 个靶点相互作用，每个靶点平均与12.96 个成分相互作用；每个靶点平均与9.41 个通路相互作用，每个通路平均与34.80 个靶点作用，因此在乳腺康中存在一个成分与多个靶点相互作用，也存在一个靶点与多个成分相互作用；存在一个靶点与多个通路相互作用，也存在一个通路与多个靶点作用。这体现了中药多成分与多靶点、多通路相互作用的整体性与联系性。

2.1.5 靶点通路分析 为进一步观察作用靶标的生物学功能，将所有化合物靶点基因导入到DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）[10]中对其进行通路富集分析。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择“OFFICIALGENE SYMBOL”，List Type设置为“Gene List”，提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，选择基因本体功能（Gene Ontology，GO）生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gene andGenomes，KEGG）信号通路富集分析，点击“Functional AnnotationChart”获得通路富集结果。使用Omicshare数据库（https:// www.omicshare.com/）绘制成气泡图，用GraphPad Prism软件绘制柱状图[11]。

通过数据库DAVID 进行的GO 功能富集分析得到GO 条目175 个（ P ＜0.05 ），其中生物过程（BP ）条目94 个，细胞组成（CC ）条目35 个，分子功能（MF ）条目46 个，分别占54% 、20% 、26% ，结果如图3 所示。

KEGG 通路富集分析筛选得到113 条（ P ＜0.05 ）信号通路，涉及乙型肺炎、胰腺癌、前列腺癌等，其中乙型肺炎通路涉及 E2F1 、 TNF 、 TP53 等基因；胰腺癌通路涉及 PIK3CG 、 E2F1 、 EGFR 等基因；前列腺癌通路涉及 PIK3CG 、 AR 、 CREB1 、 TP53 等基因，乙型肺炎、前列腺癌等均含有 TP53 基因，文献表明 [28] TP53 基因为乳腺癌作用的重要基因之一。选 P 值最小的20 个通路进行可视化，结果如图4 所示。

2.1.6 成分-靶点分子对接分析 先从RSCB PDB数据库（https://www.rscb.org/）下载酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TK，PDB ID：2B4S）的3D结构的pdb格式文件，运用Discovery Studio 2020 Client软件移除靶蛋白中的非蛋白分子和配体再保存为pdb后缀的文件[12]。从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载关键成分2D结构的sdf格式文件。利用PyRx软件先上传去水加氢后的蛋白质文件，将其转化为pdbqt格式文件，再上传化合物文件使其能量最小化，并将其转化为pdbqt格式文件，最后运用vina进行对接[13]。结合能＜0说明配体与受体可以自发结合，研究选取结合能≤−5 kJ/mol[14]的活性成分作为乳腺康的筛选依据。

一般认为配体与受体结合的构象越稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。本研究分子对接结果显示，与酪氨酸激酶结合能量较低的化合物分别是蒲公英赛醇（结合能为−36.40 kJ/mol ）等，以结合能≤−5 kJ/mol 为筛选标准，可知，乳腺康中主要活性成分与酪氨酸激酶结合能远小于−5 kJ/mol ，如表2 所示。由此可见，乳腺康中核心成分与酪氨酸激酶形成构象能量低，结构稳定，结合活性高。根据分子对接结果，查阅相关文献报道 [21-23] 及依据《中国药典》2020 年版一部中对药材指标性成分规定，最终确定川陈皮素、甘草查尔酮A 、橙皮苷、甘草酸铵、咖啡酸为乳腺康质量控制的活性成分群。

2.2 活性成分群含量测定方法的建立

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品甘草查尔酮A 2.82 mg、川陈皮素2.58 mg、橙皮苷5.31 mg、甘草酸铵7.63 mg、咖啡酸3.07 mg分别置于25、50、50、50、25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成质量浓度分别为甘草查尔酮A 112.8 μg/mL、川陈皮素51.6 μg/mL、橙皮苷106.2 μg/mL、甘草酸铵152.6 μg/mL、咖啡酸122.8 μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“1.2”项下3味中药饮片适量，加10～15倍溶媒，浸泡30～60 min，提取1～3次，每次提取30～90 min，滤过，合并滤液，冷却至室温，量取总体积，精密移取500 μL提取液加溶媒定容至10 mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 采用Supersil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；体积流量为1 mL/min；检测波长：先在全波长200～400 nm下测定，后根据各对照品最大吸收波长切换检测波长；以乙腈-0.5%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱[15]（0～20 min，10%～32%乙腈；20～50 min，32%～70%乙腈；50～60 min，70%～10%乙腈）检测甘草酸铵（237nm）、橙皮苷（284 nm）、川陈皮素（330 nm）、甘草查尔酮A（361 nm）；以甲醇-0.15%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱[15]（0～20 min，20%甲醇；20～40 min，20%～30%甲醇；40～50 min，30%～20%甲醇）检测咖啡酸（323nm）。

2.2.4 专属性试验 精密移取“2.2.1”项下对照品溶液、“2.2.2”项下供试品溶液各10 μL，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定。结果表明，供试品溶液在对照品相同保留时间的出峰位置处分别与对照品色谱峰对应一致。色谱图见图5。

2.2.5 线性关系考察 分别精密移取甘草查尔酮A、川陈皮素、橙皮苷、甘草酸铵、咖啡酸对照品溶液2 mL，分别采用二倍稀释法，制得6个样品[16]，采用“2.2.3”项下色谱条件进样测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程分别为甘草查尔酮A Y＝45 536 X＋8624，r＝0.995 1；川陈皮素Y＝46 332 X－18 169，r＝0.998 9；橙皮苷Y＝20421 X－9715，r＝0.998 0；甘草酸铵Y＝10 828 X－22 550，r＝0.997 1；咖啡酸Y＝138 662 X－ 199 822，r＝0.999 3；结果表明，甘草查尔酮A在3.5～112.8 μg/mL、川陈皮素在1.6～51.6μg/mL、橙皮苷在3.3～106.2μg/mL、甘草酸铵在4.8～152.6μg/mL、咖啡酸在3.8～122.8μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 量取对照品溶液适量，按照“2.2.3”项下色谱条件，连续进样测定6次，记录峰面积[17]。计算得甘草查尔酮A、川陈皮素、橙皮苷、甘草酸铵、咖啡酸峰面积的RSD分别为1.44%、1.95%、1.08%、1.32%、0.36%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取样品6份，依法制备供试品溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量[18]。结果甘草查尔酮A、川陈皮素、橙皮苷、甘草酸铵、咖啡酸质量分数的RSD分别均小于5%，表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样，按照“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果甘草查尔酮A、川陈皮素、橙皮苷、甘草酸铵、咖啡酸峰面积的RSD均小于5%，表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定[19]。

2.2.9 样品测定 将“2.2.2”项下制备的供试品溶液按照“2.2.3”项下色谱条件进样测定。

2.3 设计空间法优化乳腺康提取工艺

2.3.1 关键质量属性（CQA）和关键工艺参数（CPP）的确定 生产工艺风险评估需要保证能够对生产工艺中所有的CQA和CPP进行充分的控制。

（1）CQA的确定：对乳腺康提取过程中干膏率和指标性成分含量进行CQA确定。结合乳腺康中网络药理学、文献中药效活性的研究[29-30]及《中国药典》2020年版一部中对各药材指标性成分的规定，将干膏得率（Y1）及甘草查尔酮A、甘草酸铵、川陈皮素、橙皮苷、咖啡酸的提取量（Y2～Y6）作为乳腺康制备工艺的CQA。

（2）CPP的确定：对乳腺康提取工艺过程中在药材、溶剂、提取操作、滤过操作等方面所涉及的潜在CPP［提取时间（X1）、加溶媒量（X2）、提取次数（X3）、浸泡时间（X4）、乙醇体积分数（X5）］进行筛选及风险评估。利用Minitab 18软件进行Plackett-Burman实验设计，筛选出对乳腺康成分含量影响较大的CPP，结果见表4。

分别以Y1～Y6对X1～X5进行线性回归，得回归方程：Y1＝6.36－0.1273 X1＋0.447 X2＋5.158 X3＋0.032 7 X4＋0.021 4 X5，Y2＝−2.58×10−3＋2.0×10−5 X1＋1.27×10−4 X2＋4.17×10−4 X3＋1.9×10−5 X4＋ 1×10−6 X5，Y3＝0.031 9＋1.038×10−3 X1－2.25×10−3 X2＋0.020 5 X＋5.17×10−4 X4－3.72×10−4 X5，Y4＝0.037 3－2.57×10−4 X1－1.37×10−4 X2＋4.74×10−3 X3＋3.79×10−4 X4－8.5×10−5 X5，Y5＝−1.028＋4.8×10−4 X1＋0.066 0 X2＋0.653 3 X3＋2.08×10−3 X4＋5.93×10−3 X5，Y6＝1.45－0.028 51 X1＋0.297 X2＋1.485 X3＋5.7×10−3 X4－0.022 14 X5。

方差分析见表5，由表5可知Y1、Y3～Y6均对X1、X3或X5显著；标准化效应的pareto图见图6，效应值影响较大的工艺参数分别为X1、X3、X5。结合方差分析和pareto图最终筛选出提取时间X1、提取次数X3、乙醇体积分数X5作为CPP。

2.3.2 Box-Behnken设计实验优化乳腺康最佳提取工艺参数 根据Plackett-Burman实验结果，以X1、X3和X5为自变量，以Y1～Y6为响应值，利用软件Design-Expert 10，设计3因素3水平实验，共有17个试验点，中心点5个，实验设计与结果见表6。

2.3.3 设计空间计算和验证 通过Monte CarLo法计算获得基于达标概率的设计空间，将Box- Behnken实验的数据，进行计算机模拟1万次，计算步长为0.02，达标概率为0.9可以获得较满意结果[20]，建立设计空间-采用MatLab（2018b）软件提供的Monte CarLo方法计算获得乳腺康提取工艺参数的设计空间图，见图7。在最佳提取工艺范围点内A（−0.26，−0.58，−0.54）、点外B（−0.38，0，0.36）分别选择1个点平行进行2组实验，测定，干膏率、甘草查尔酮A、甘草酸铵和橙皮苷最佳工艺点内A高于点外B，川陈皮素和咖啡酸含量点外B高于点内A，综合评分（综合评分＝干膏率/最大干膏率×10＋甘草查尔酮A质量浓度/最大甘草查尔酮质量浓度A×30＋甘草酸铵质量浓度/最大甘草酸铵质量浓度×10＋川陈皮素质量浓度/最大川陈皮素质量浓度×30＋橙皮苷质量浓度/最大橙皮苷质量浓度×10＋咖啡酸质量浓度/最大咖啡酸质量浓度×10）最佳工艺点内A优于点外B，见表7。

4 讨论

本研究采用网络药理学对乳腺康组方青皮、蒲公英、甘草的主要活性成分和作用靶点进行网络分析。根据网络药理学研究结果，对原药材中的蒲公英甾醇等成分进行了含量测定，发现其在原药材中的含量远远低于万分之一，甚至有的低于检测限， 无法对其进行测定，这也是网络药理学筛选方法的局限性 [24] ，即只考虑成分“有无”，对其“含量高低”考虑不多。目前，多数中药工艺研究过程中，多以药材的指标性化学成分作为工艺筛选的指标，但这些化学成分是否与药物临床药效相关尚未可知，本研究以药物、临床适应症为指标，通过网络药理学筛选出乳腺康的潜在活性成分，结合《中国药典》2020 年版一部青皮、甘草、蒲公英的指标性成分，活性成分群在提取液中的含量，采用综合评分法作为工艺评价指标对其提取工艺进行筛选，间接地对药物活性进行控制，改进了目前多数工艺以药材中指标性成分为指标而与药物临床相关性不强的不足。

通过研究，最终确定川陈皮素、甘草查尔酮A 、橙皮苷、甘草酸铵及咖啡酸为乳腺康质量控制的活性成分群。并以此为指标通过分析软件进行DOE 试验设计和设计空间对乳腺康提取工艺进行设计并优化。结果表明，提取次数、乙醇体积分数、加溶媒量、提取时间、浸泡时间均对乳腺康的提取工艺具有影响，其中提取次数、提取时间和乙醇体积分数的影响较为显著。得到乳腺康提取的最佳工艺为浸泡时间为30 min 、溶媒量为12 倍、提取时间45 ～75 min 、乙醇体积分数为65% ～80% 、提取2 ～3 次。

现有的中药复方提取多采用单因素、正交试验，并未完全反映中药复方提取的工艺参数动态化。本研究在掌握CQA 与CPP 的基础上，通过实验设计分析各影响因素对最终产品质量的影响 [25] 。在Plackett-Burman 实验的基础上进一步对工艺进行优化，在Box-Behnken 实验过程中应该严格按照实验设计进行，减少因为组数较多引起的误差 [26] ，并对Box-Behnken 实验结果通过Monte CarLo 法计算获得基于达标概率的设计空间，计算机模拟1 万次，计算步长为 0.02 ，达标概率为 0.9 可以获得较满 意结果并参照文献 [27] 进行验证，验证实验结果与空间预测结果一致，表明该设计空间法运用于乳腺康提取工艺稳定可行，该方法使提取工艺参数更加动态化，为实际大生产中工艺参数筛选提供一种思路。

本研究通过网络药理学与分子对接技术筛选出乳腺康的CQA ，采用设计空间法对乳腺康进行提取工艺研究，用大数据分析和计算机模拟与实验数据相结合，对乳腺康指标性成分筛选到最终提取工艺的初步确定进行研究，避免了提取工艺的临床利用与指标性不强的问题和提取工艺参数筛选盲目性，具有一定的创新性。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：刘博文，戴 静，刘晓凤，闫博文，邓 妍，刘 涛．基于网络药理学和设计空间的乳腺康提取工艺研究 [J]. 中草药, 2021, 52(6):1634 -1644 .

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